利用TMV CP融合蛋白的形式表达口蹄疫

一、项目介绍

    烟草花叶病毒（TMV）是一种宿主范围广泛的正链杆状植物病毒，它可以在宿主体内高效复制和表达，又能在体外稳定存在。其中外壳蛋白（CP）的表达量可以达到宿主总蛋白的百分之七。外壳蛋白可以耐受一定程度的修饰而不影响其对病毒基因组RNA的包装。将较短的外源小肽插入TMV CP基因的末端，可以在不影响病毒复制的前提下，达到高效表达外源基因的目的，如表达病原的抗原决定小肽。

    口蹄疫病毒FMDV( Foot and Mouth Disease Virus)是一种在世界范围内严重危害产肉及产奶家畜的病毒，目前除灭活病毒疫苗外，还没有有效的基因工程疫苗。而灭活病毒疫苗虽然免疫效果较好，但有时也会由于灭活不完全反而导致疫情的爆发，所以欧共体目前已限制灭活疫苗的使用。亚洲包括中国是口蹄疫的多发地区，每年对畜牧业生产造成巨大损失，因此开发具有高效、安全、廉价的口蹄疫疫苗具有广泛的社会意义和重大的经济价值。

    我们设计将口蹄疫病毒FMDV的抗原决定蛋白序列插入TMV CP序列的3’端，使之在CP的羧端与外壳蛋白形成融合蛋白，却不影响病毒的复制表达和在植物体内远距离运输。而外源小肽以极高的密度呈现在TMV病毒颗粒表面，这对激发动物的免疫反应将使十分有利的。我们已用该系统成功地表达了FMDV“OK1”株系的抗原决定小肽（11肽、12肽A、13肽B、14肽和20肽）。重组烟草花叶病毒感染烟草两周后，植株出现典型的花叶症状。经RT—PCR检测新生叶片，证实该重组病毒可以在烟草内有效地复制表达，并系统感染整株烟草。感染叶片的总蛋白SDS PAGE，经染色后可见明显的融合有外源小肽的TMV CP条带，表达量接近野生TMV外壳蛋白的表达量。经三次传代后，RT-PCR和Western blot检测显示，重组TMV病毒基因组的结构稳定，能保持持续稳定地表达口蹄疫病毒小肽。重组TMV感染烟草四周后，收获叶片经PEG沉淀和超离心法纯化，既可获得高纯度的重组TMV颗粒。每一百克烟草鲜叶可获得1—2克高纯度的融合有11肽或0.5克14肽的重组TMV病毒。而且纯化后的重组TMV结构稳定，可以在4℃长期保存。

    我们以豚鼠为试验对象（试验表明豚鼠与猪对FMDV的免疫力基本一致），对11肽和14肽CP融合小肽进行了免疫效力的测定。实验共设四组，分别以0.6mg野生型TMV CP（阴性对照）、兰州浓缩苗、0.2mgTMV CP11和0.4mgTMV CP14一次或两次免疫豚鼠，初次免疫后42天以50倍豚鼠ID50（豚鼠半致病剂量）的FMDV攻毒。结果一次和两次免疫组的豚鼠保护率分别达到80%和100%，而阴性对照组豚鼠全部死亡。进一步的乳鼠保护实验结果表明经重组TMV免疫的豚鼠抗血清对乳鼠的保护指数可达到2.0，。以上试验结果显示CP融合小肽具有良好的免疫原性，能在接受免疫的动物体内激发产生较高水平的中和抗体。

利用植物病毒表达外源基因是一个非常有前途的研究方向，植物表达系统属于高等真核系统，特别在生产各种用于预防和治疗的多肽药物方面，更接近动物系统。而且具有生产投入成本低，表达量高，纯化容易的优点。另外该系统略加改变就可用来表达其它各种抗原小肽，具有广泛应用潜力。

二、合作方式

    面议。